IPTG (isopropyl-β-D-tiogalaktosid) er en analog av β-galaktosidasesubstratet, som er svært induserbar. Under induksjon av IPTG kan induseren danne et kompleks med repressorproteinet, slik at konformasjonen til repressorproteinet endres, slik at det ikke kan kombineres med målgenet, og målgenet uttrykkes effektivt. Så hvordan bør konsentrasjonen av IPTG bestemmes under eksperimentet? Er det bedre jo større?
La oss først forstå prinsippet bak IPTG-induksjon: E. colis laktoseoperon (element) inneholder tre strukturelle gener, Z, Y og A, som koder for henholdsvis β-galaktosidase, permease og acetyltransferase. lacZ hydrolyserer laktose til glukose og galaktose, eller til allolaktose; lacY lar laktose i miljøet passere gjennom cellemembranen og inn i cellen; lacA overfører acetylgruppen fra acetyl-CoA til β-galaktosid, noe som innebærer å fjerne den toksiske effekten. I tillegg finnes det en operasjonssekvens O, en startsekvens P og et regulatorisk gen I. I-genkoden er et repressorprotein som kan binde seg til posisjon O i operatorsekvensen, slik at operonet (meta) undertrykkes og slås av. Det finnes også et bindingssted for det katabolske genaktivatorproteinet – CAP-bindingsstedet oppstrøms for initieringssekvensen P. P-sekvensen, O-sekvensen og CAP-bindingsstedet utgjør sammen den regulatoriske regionen til lac-operonet. De kodende genene til de tre enzymene reguleres av den samme regulatoriske regionen for å oppnå koordinert uttrykk av genprodukter.
I fravær av laktose er lac-operonet (meta) i en represjonstilstand. På dette tidspunktet binder lac-repressoren uttrykt av I-sekvensen under kontroll av PI-promotorsekvensen seg til O-sekvensen, noe som forhindrer RNA-polymerase i å binde seg til P-sekvensen og hemmer transkripsjonsinitiering. Når laktose er til stede, kan lac-operonet (meta) induseres. I dette operon (meta)-systemet er den virkelige induseren ikke laktose i seg selv. Laktose kommer inn i cellen og katalyseres av β-galaktosidase for å bli omdannet til allolaktose. Sistnevnte, som et indusermolekyl, binder seg til repressorproteinet og endrer proteinkonformasjonen, noe som fører til dissosiasjon av repressorproteinet fra O-sekvensen og transkripsjon. Isopropyltiogalaktosid (IPTG) har samme effekt som allolaktose. Det er en veldig kraftig induser som ikke metaboliseres av bakterier og er veldig stabil, så den er mye brukt i laboratorier.
Hvordan bestemme den optimale konsentrasjonen av IPTG? Ta E. coli som et eksempel.
Den genetisk modifiserte E. coli BL21-stammen som inneholdt den positive rekombinante pGEX (CGRP/msCT) ble inokulert i flytende LB-medium som inneholdt 50 μg·mL-1 Amp, og dyrket over natten ved 37 °C. Kulturen ovenfor ble inokulert i 10 flasker med 50 ml friskt flytende LB-medium som inneholdt 50 μg·mL-1 Amp i et forhold på 1:100 for ekspansjonskultur, og når OD600-verdien var 0,6~0,8, ble IPTG tilsatt til den endelige konsentrasjonen. Den er 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Etter induksjon ved samme temperatur og samme tid ble 1 ml av bakterieløsningen tatt fra den, og bakteriecellene ble samlet opp ved sentrifugering og utsatt for SDS-PAGE for å analysere påvirkningen av forskjellige IPTG-konsentrasjoner på proteinuttrykk, og deretter velge IPTG-konsentrasjonen med det største proteinuttrykket.
Etter eksperimenter vil det vise seg at konsentrasjonen av IPTG ikke er så høy som mulig. Dette er fordi IPTG har en viss toksisitet for bakterier. Overskridelse av konsentrasjonen vil også drepe cellen; og generelt sett håper vi at jo mer løselig protein som uttrykkes i cellen, desto bedre, men i mange tilfeller når konsentrasjonen av IPTG er for høy, vil det dannes en stor mengde inneslutning. Kroppen, men mengden løselig protein reduseres. Derfor er den mest passende IPTG-konsentrasjonen ofte ikke jo større jo bedre, men jo lavere konsentrasjonen er.
Formålet med induksjon og dyrking av genmodifiserte stammer er å øke utbyttet av målproteinet og redusere kostnadene. Ekspresjonen av målgenet påvirkes ikke bare av stammens egne faktorer og ekspresjonsplasmidet, men også av andre eksterne forhold, som konsentrasjonen av induseren, induksjonstemperaturen og induksjonstiden. Derfor er det generelt best å studere induksjonstid, temperatur og IPTG-konsentrasjon før et ukjent protein uttrykkes og renses for å velge passende forhold og oppnå de beste eksperimentelle resultatene.
Publiseringstid: 31. desember 2021