Ditiotreitol (DTT) er et vanlig brukt reduksjonsmiddel, også kjent som det nye grønne tilsetningsstoffet. Det er en liten molekylær organisk forbindelse med to merkaptangrupper (-SH). På grunn av sine reduserende egenskaper og stabilitet er DTT mye brukt i biokjemi og molekylærbiologiske eksperimenter.
Hovedrollen til DTT er å redusere disulfidbindinger i proteiner og andre biomolekyler. Disulfidbindingen er en viktig del av proteinfolding og stabilitet, men under visse eksperimentelle forhold, som reduserbar SDS-PAGE-analyse, proteinrekombinasjon og folding, er det nødvendig å redusere disulfidbindingen til to tiolgrupper for å avdekke proteinets romlige struktur. DTT kan reagere med disulfidbindinger for å redusere dem til merkaptangrupper, og dermed åpne opp proteinets romlige struktur og gjøre det enkelt å analysere og manipulere.
DTT kan også brukes til å beskytte enzymaktivitet og stabilitet. I noen enzymkatalyserte reaksjoner kan enzymets aktivitet reduseres av oksidasjonsmidlet. DTT kan reagere med oksidasjonsmidler for å redusere dem til ufarlige stoffer, og dermed beskytte enzymets aktivitet og stabilitet.
Sammenlignet med tradisjonelle reduksjonsmidler som β-merkaptoetanol (β-ME), regnes DTT som et tryggere og mer stabilt reduksjonsmiddel. Det er ikke bare stabilt i vandig løsning, men beholder også sine reduserende egenskaper under høy temperatur og syre-baseforhold.
Bruken av DTT er relativt enkel. Generelt løses DTT opp i en passende buffer og tilsettes deretter til det eksperimentelle systemet. Den optimale konsentrasjonen av DTT må bestemmes i henhold til det spesifikke eksperimentet, og brukes vanligvis i området 0,1–1 mM. Lavere konsentrasjoner kan redusere bivirkninger på cellevekst og kan redusere cytotoksisitet på grunn av overekspresjon av målproteiner. Høyere konsentrasjoner kan forårsake overdreven cellemetabolsk belastning, noe som påvirker cellevekst og ekspresjonseffektivitet.
Måten å bestemme den optimale konsentrasjonen på kan være å evaluere uttrykknivået til målproteinet ved å utføre IPTG-induksjonstester ved forskjellige konsentrasjoner. Småskala kulturtester kan utføres ved bruk av en rekke IPTG-konsentrasjoner (f.eks. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, osv.), og uttrykkeffekten ved forskjellige konsentrasjoner kan evalueres ved å detektere uttrykknivået til målproteinet (f.eks. Western blot eller fluorescensdeteksjon). I henhold til de eksperimentelle resultatene ble konsentrasjonen med best uttrykkeffekt valgt som optimal konsentrasjon.
I tillegg kan du også referere til relevant litteratur eller erfaring fra andre laboratorier for å forstå det vanlige IPTG-konsentrasjonsområdet under lignende eksperimentelle forhold, og deretter optimalisere og justere i henhold til de eksperimentelle behovene.
Det er viktig å merke seg at den optimale konsentrasjonen kan variere avhengig av ulike uttrykkssystemer, målproteiner og eksperimentelle forhold, så det er best å optimalisere fra tilfelle til tilfelle.
Kort sagt er DTT et vanlig brukt reduksjonsmiddel som kan brukes til å redusere disulfidbindinger i proteiner og andre biomolekyler, og for å beskytte enzymaktivitet og stabilitet. Det har blitt mye brukt i biokjemi og molekylærbiologiske eksperimenter.
Publisert: 28. september 2023