Dithiothreitol (DTT) er et ofte brukt reduksjonsmiddel, også kjent som det nye grønne tilsetningsstoffet.Det er en liten molekylær organisk forbindelse med to merkaptangrupper (-SH).På grunn av sine reduserende egenskaper og stabilitet, er DTT mye brukt i biokjemi og molekylærbiologiske eksperimenter.
Hovedrollen til DTT er å redusere disulfidbindinger i proteiner og andre biomolekyler.Disulfidbindingen er en viktig del av proteinfolding og stabilitet, men under visse eksperimentelle forhold, som reduserbar SDS-PAGE-analyse, proteinrekombinasjon og folding, er det nødvendig å redusere disulfidbindingen til to tiolgrupper for å avdekke den romlige strukturen til proteinet.DTT kan reagere med disulfidbindinger for å redusere dem til merkaptangrupper, og dermed åpne opp den romlige strukturen til proteinet og gjøre det enkelt å analysere og manipulere.
DTT kan også brukes til å beskytte enzymaktivitet og stabilitet.I noen enzymkatalyserte reaksjoner kan aktiviteten til enzymet reduseres av oksidanten.DTT kan reagere med oksidanter for å redusere dem til ufarlige stoffer, og dermed beskytte aktiviteten og stabiliteten til enzymet.
Sammenlignet med tradisjonelle reduksjonsmidler som β-merkaptoetanol (β-ME), anses DTT for å være et sikrere og mer stabilt reduksjonsmiddel.Det er ikke bare stabilt i vandig løsning, men opprettholder også sine reduserende egenskaper under høye temperaturer og syre-base forhold.
Bruken av DTT er relativt enkel.Generelt blir DTT oppløst i en passende buffer og deretter tilsatt til det eksperimentelle systemet.Den optimale konsentrasjonen av DTT må bestemmes i henhold til det spesifikke eksperimentet, og brukes vanligvis i området 0,1-1 mM.Lavere konsentrasjoner kan redusere negative effekter på cellevekst og kan redusere cytotoksisitet på grunn av overekspresjon av målproteiner.Høyere konsentrasjoner kan forårsake overdreven cellemetabolsk belastning, som påvirker cellevekst og ekspresjonseffektivitet.
Måten å bestemme den optimale konsentrasjonen på kan være å evaluere ekspresjonsnivået til målproteinet ved å utføre IPTG-induksjonstester ved forskjellige konsentrasjoner.Småskala kulturtester kan utføres ved å bruke en rekke IPTG-konsentrasjoner (f.eks. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, etc.), og ekspresjonseffekten ved forskjellige konsentrasjoner kan evalueres ved å detektere ekspresjonsnivået til målproteinet (f.eks. Western blot eller fluorescensdeteksjon).I følge forsøksresultatene ble konsentrasjonen med best ekspresjonseffekt valgt som optimal konsentrasjon.
I tillegg kan du også referere til relevant litteratur eller erfaring fra andre laboratorier for å forstå det vanlig brukte IPTG-konsentrasjonsområdet under lignende eksperimentelle forhold, og deretter optimalisere og justere i henhold til de eksperimentelle behovene.
Det er viktig å merke seg at den optimale konsentrasjonen kan variere avhengig av forskjellige ekspresjonssystemer, målproteiner og eksperimentelle forhold, så det er best å optimalisere fra sak til sak.
Oppsummert er DTT et ofte brukt reduksjonsmiddel som kan brukes til å redusere disulfidbindinger i proteiner og andre biomolekyler og for å beskytte enzymaktivitet og stabilitet.Det har blitt mye brukt i biokjemi og molekylærbiologiske eksperimenter.
Innleggstid: 28. september 2023